Entrevista a la Dra. Larissa Zárate García

journal Raicex

Especialista en citometría de flujo en el Imperial College London

Durante más de medio siglo, en el campo de la biología reproductiva, no se había puesto en duda que no existen células madre germinales en el ovario adulto de los mamíferos. Sin embargo, en el 2004, unos investigadores desafiaron este dogma al observar en ratones cómo se reestablecía el folículo primordial tras haber sido sometidos a un tratamiento genotóxico. Este cambio de paradigma fue sucedido por otros estudios que obtuvieron resultados contradictorios, por lo que se ha generado gran controversia en torno a este tema. Los resultados publicados en 2016 en la revista Scientific Reports con Larissa Zárate como primera autora sugieren que, como solía creerse, el ovario adulto está poblado por un número fijo de oocitos y que no existe producción de novo a niveles significantes.

Larissa nace en Miranda de Ebro (Burgos) y cursa una licenciatura de Biología por la Universidad de Salamanca. Es Máster en Técnicas de Reproducción Asistida por la Universidad de Valencia y experta en comunicación científica por la Organización de Estados Iberoamericanos. Gracias a su experiencia en unidades de reproducción asistida en España y Portugal, consiguió entrar en un doctorado en la Universidad de Southampton, donde investigó la existencia y posible uso terapéutico de células madre ováricas en el ovario adulto, utilizando para ello técnicas de citometría de flujo. Gracias a esta experiencia ha trabajado como especialista en citometría de flujo en el Royal Veterinary College de Londres, y desde 2020 en el Imperial College London. Y hoy tenemos la oportunidad de entrevistarla.

Dra. Larissa Zárate García

My Scientific Journal. Según explicáis en vuestra publicación de 2016 (ver referencias), parte de la confusión existente nace a raíz de que es posible separar o identificar células madre ováricas adultas utilizando un anticuerpo dirigido contra DDX4, cuando en realidad se ha comprobado que estas células no expresan esa proteína en su superficie, por lo que no deberían separarse en base a esto. Que el anticuerpo identifique una proteína diferente a DDX4 se debe a que presenta reactividad cruzada, es decir, que se une a una proteína que es diferente de la que debería (para la que se desarrolló). ¿Por qué ocurre esta reactividad cruzada? ¿Cómo se puede solventar este problema en una investigación: usando un anticuerpo diferente o buscando otro marcador o indicador?

Larissa Zárate García. No es que estas células no expresen DDX4 en superficie. Es que no la expresan en absoluto. La reactividad cruzada es uno de los mayores temores cuando se investiga con técnicas de inmunofenotipado. Principalmente ocurre por un mal diseño del anticuerpo comercial. Por ejemplo, porque se tome una secuencia de aminoácidos muy pequeña de la proteína de interés como patrón para desarrollar el anticuerpo. Cuanto más pequeño es este epítopo, más posibilidades de que coincida con secuencias de proteínas diferentes, y por tanto que el anticuerpo se una a ellas. También puede ocurrir que se elija un epítopo cuyo papel en la función de la proteína no se comprenda bien, y se pasen por alto modificaciones post-transcripcionales y plegamientos terciarios que la asemejen a partes de otra proteína. Los anticuerpos policlonales, desarrollados en una especie para reconocer la misma proteína en otras tantas especies, también podrían presentan problemas. Si el epítopo no está bien conservado evolutivamente entre especies, es muy probable que se produzca reactividad cruzada. En el caso que nos ocupa de este anticuerpo anti-DDX4, presentaba estos tres problemas: anticuerpo policlonal desarrollado en conejos pero usado en ratones y humanos, un epítopo muy corto y en una región de la proteína cuya función se desconoce. Por último están los efectos del propio protocolo de immunofenotipado sobre las proteínas, que es más difícil de predecir: los tipos de compuestos químicos, tiempos que se exponen a las células e incluso la temperatura pueden afectar a la estructura proteica, especialmente en las proteínas de membrana.

Entender qué proteínas son exclusivas de las células que queremos estudiar, y cómo funcionan aquéllas de interés es esencial para empezar a solventar estos problemas de reactividad cruzada. Por ejemplo, a la hora de aislar una célula madre, en vez de uno se pueden utilizar dos o más marcadores de superficie exclusivos para asegurar doblemente la pureza de los resultados. En las células madre germinales es bastante complicado, porque no expresan prácticamente proteínas de superficie exclusivas. Por eso varios grupos han utilizado ratones transgénicos donde la expresión de Ddx4 causa fluorescencia, para aislar estas supuestas células madre ováricas sin necesidad de utilizar anticuerpos en el proceso. Ahora bien, sería un modelo imposible de aplicar en investigación en pacientes, y el aislamiento seguiría confiando en marcadores de superficie.

Dra. Larissa Zárate García

MSCJ. De acuerdo con vuestros resultados es altamente improbable que las supuestas células madre ováricas tengan funciones fisiológicas en el mantenimiento o restauración de oocitos en el organismo adulto. Pero ¿serían buenas noticias si esto no fuese así? Es decir, si existiesen estas células madre adultas en el ovario ¿se podrían emplear, por ejemplo, para evitar el fallo ovárico prematuro que ocurre a las pacientes de cáncer sometidas a un tratamiento quimioterápico, en otras situaciones patológicas o incluso para la fecundación in vitro?

LZG. En un mundo donde una de cada tres parejas heterosexuales tiene problemas para concebir, conseguir una fuente in vitro de oocitos viables sería una de las mejores noticias del siglo XXI. Lo que sabemos hasta el momento es que las células madre ováricas se transforman en oocitos o mueren y se extinguen durante la etapa fetal. Las niñas y mujeres adultas no tienen células madre germinales. Sin embargo, se cree que el ovario contiene muchas otras líneas de células madre desconocidas, con potencial para utilizarse para reactivar la función ovárica.

Por ejemplo, el epitelio que recubre el ovario está repleto de células madre que lo reparan y regeneran tras cada ovulación. Pero como digo, aún no se han investigado bien. El problema aquí es que para obtener estas células madre hay que quitarle un trocito de ovario a una mujer, con todos los problemas secundarios que se derivan de una intervención quirúrgica y también éticos. Hikabe et al. 2016 consiguieron unos pocos oocitos competentes transformando fibroblastos de piel adulta de ratón con métodos de cultivo secuenciales, sin modificación génica de por medio. ¿Necesitamos entonces buscar células madre en el ovario cuando otras más accesibles dan resultados prometedores?

También hay otro gran escollo que planteó el estudio de Hikabe, y es que estos oocitos que obtenían necesitaban células perinatales de la granulosa para salir adelante. La granulosa digamos que es la nodriza del oocito: lo acompaña desde que nace hasta que ya como embrión se implanta en el útero, y sin ella no puede alimentarse ni sobrevivir. En el ovario adulto no parece haber células madre de la granulosa, y tampoco sabemos conseguirlas en una placa de cultivo. Solucionar la esterilidad pasa pues por conseguir células madre ováricas y de la granulosa competentes, por replicar el nicho celular prenatal, y para ello quedan algunas décadas de trabajo. Pero no tengo dudas de que acabará ocurriendo en este siglo.

MSCJ. Los resultados de vuestros análisis computacionales han resultado ser más acertados que los modelos desarrollados en cultivos celulares o utilizando modelos animales. Todos son modelos que se emplean frecuentemente en investigación, sin embargo, intuitivamente nos suele generar más confianza un cultivo o un ratón que un ordenador. ¿Puede ser que estas metodologías tan comúnmente utilizadas sean modelos más alejados de la realidad de lo que creemos y que, por el contrario, los modelos computacionales resulten más adecuados para hacer predicciones?

LZG. Sí, ahora mismo los modelos computacionales son uno de los pilares de la investigación. Permiten analizar cientos de predicciones en mucho menos tiempo que con modelos animales o celulares. Sin ir más lejos, ahora mismo vacunas como la de COVID se desarrollan inicialmente con modelos computacionales que se procesan en superordenadores en las universidades. Imaginemos lo que habría tardado esta vacuna de no haber tenido estas herramientas. Luego claro, estas predicciones se prueban en cultivos celulares, y más tarde a nivel metabólico en organismos completos, porque al final hay que investigar sus efectos de forma escalonada y global.

Hay que pensar que al ahorro de tiempo se une el ahorro económico, pues mantener colonias de ratones y cultivos celulares, o comprar reactivos para un fenotipado hasta dar con el adecuado, puede llevarse un gran porcentaje de la financiación de un proyecto. Otro aspecto importante es el ético. Al trabajar con animales de experimentación, en Biología aplicamos la Regla de las Tres Erres: reemplazar, reducir y refinar con el fin de utilizar cuantos menos animales y con el menor menoscabo a su salud. Un modelo computacional es el ideal en la aplicación de estas leyes, porque me va a permitir reemplazar a los animales en ciertas etapas, reducir aquellos que necesite para comprobar mis resultados in vivo, y refinar la técnica una vez sepa qué resultados esperar.

Los modelos experimentales van a verse cada vez más en investigación, pero para ello necesitaremos contar bien con nociones de programación, bien con ingenieros de software que sepan llevar a la práctica nuestras necesidades. Caminamos hacia equipos interdisciplinares en este sentido.

MSCJ. Vuestro estudio demuestra que la principal técnica utilizada en el campo de la biología reproductiva para aislar células madre germinales a partir del ovario resulta estar basada en suposiciones falsas asumidas como verdaderas. Tras leer el artículo solo podemos pensar que hay que ser realmente valientes para poner en tela de juicio lo asumido o establecido. ¿Piensas que es necesario que los investigadores seamos más atrevidos o escépticos y, tal como vosotros habéis hecho, se cuestionen y desafíen los dogmas?

LZG. Cuando mi director de tesis me planteó este proyecto, la investigación original provenía de Harvard y estaba publicada en Nature. Parecía muy seria y verídica. Nuestro objetivo era replicar el protocolo de aislamiento y analizar la calidad meiótica de los oocitos que se formaban. Luego vas viendo resultados que no encajan, dificultades aún siguiendo el protocolo al pie de la letra. Al final decidí empezar a confiar más en mí que en lo que me decían las revistas de alto nivel. De ahí salió una tesis completamente diferente a la inicial, en la que aprendí muchísimo amor propio y honestidad. El dogma actual de que no existen células madre ováricas adultas es de 1870, y se pone en tela de juicio continuamente con diferentes técnicas de nueva aparición. Más que atreverse a desafiar los dogmas, en este caso el problema es la falta de replicación de resultados siguiendo el mismo protocolo, y aún peor, que estas replicaciones, fallidas o validadas, no se publican. Se quedan en un cajón y sólo se comentan en corrillos en la pausa del café de los congresos.

Entonces, en todos los campos, estamos asumiendo unas hipótesis que quizá estén completamente equivocadas. Tenemos que publicar tanto ciencia novedosa como replicaciones de estudios y protocolos, pero esto último a día de hoy no es atractivo para las revistas. Se considera una pérdida de tiempo en la carrera por asegurarse financiación.

MSCJ. En la última pregunta de esta entrevista queremos conocer un poco más tu experiencia investigadora en el extranjero. Imagino que al principio es normal tener dudas o inquietud por dejar tu país y a tus seres queridos, pero una vez allí seguro que se viven experiencias que te hacen sentir que haber tomado ese camino ha merecido la pena, ¿recuerdas algún momento o algún hecho concreto, en lo profesional o lo personal, que consiguiera hacerte sentir que sin lugar a dudas vivir esta experiencia en el extranjero ya había valido la pena?

LZG. La verdad es que sí que tuve mis dudas al empezar mi tesis, sobre todo porque en Reino Unido se espera de ti independencia a todos los niveles, mientras que en España un doctorando está más dirigido. Pero llevaba varios años buscando trabajo en España, y el último cartucho que guardaba era mudarme al extranjero.

Recuerdo con especial cariño el primer congreso en el que presenté mi investigación, donde ya denunciaba que este protocolo de aislamiento tenía muchos fallos, y que posiblemente estas células madre ováricas adultas no existían. La respuesta fue muy buena por parte de los investigadores senior, quienes me dieron muy buenos consejos de forma altruista. Me sentí muy acogida por la comunidad y como un miembro valorado. Al final en la tesis desarrollé la honestidad, el trabajar duro, la versatilidad y la improvisación, que esto es como muy español. Se nos da bien la inventiva ante problemas de última hora. Me los he llevado a subsiguientes trabajos, y han dado buenos frutos.

Referencias

Zarate-Garcia L, Lane S, Merriman J, Jones K. FACS-sorted putative oogonial stem cells from the ovary are neither DDX4-positive nor germ cells. Scientific Reports. 2016 Aug; 6. 27991. doi: 10.1038/srep27991.

Zarate-Garcia L. Understanding the meiotic competence of oocytes derived from oogonial stem cells. University of Southampton. 2017

Documentación y entrevista

Celia Gaona para My Scientific Journal 08/01/2021

Celia Gaona RomeroRedactora My Scientific Journal

Graduada en Bioquímica & Investigadora